Alan Szalai - Jueves 8 de Septiembre 11:00 hs

Localización y dinámica de receptores de membrana mediante microscopía de fluorescencia de molécula única

La transparencia óptica de los sistemas biológicos y el carácter no invasivo de la luz visible han situado a la microscopia óptica como una de las principales herramientas para el estudio de sistemas vivos. A su vez, la posibilidad de marcar específicamente componentes celulares con fluoróforos, permitió que la microscopia de fluorescencia sea una de las técnicas más ampliamente utilizadas para visualizar la vida a nivel celular y subcelular [1]. Sin embargo, en las microscopías de campo lejano el límite de resolución dado por la difracción de la luz (250 nm, límite de Abbe) representa un obstáculo para la observación de algunas estructuras y fenómenos que ocurren a nivel de la nanoescala [2]. Durante las últimas dos décadas, se han desarrollado técnicas de microscopia óptica que lograron vencer el límite de Abbe. A su vez, en algunas de estas técnicas se observan moléculas individuales, motivo por el cual es posible obtener información heterogénea en la nanoescala.
En la presente tesis, estudiamos distintos sistemas con potencialidad para la marcación de proteínas mediante moléculas fluorescentes. Por un lado, caracterizamos las propiedades fotofísicas de una serie 3-hidroxi- cromonas, que presentan una transferencia de protón intramolecular en el estado excitado que da lugar a una emisión dual debida a los dos tautómeros (estos compuestos se conocen como ESIPT). La relación de intensidades de las bandas de emisión es sensible a distintas propiedades del entorno, de modo tal que los compuestos ESIPT presentan a priori propiedades interesantes para caracterizar sitios de ligadura de enzimas, así como sus cambios dinámicos.
Un segundo sistema estudiado se centra en la marcación del receptor de tipo 1 de la hormona liberadora de corticotropina (CRHR1). Dicho receptor de membrana es de particular interés debido a su rol como regulador de CRH, cuya función en el sistema nervioso se vincula directamente a desórdenes como la depresión y ansiedad. Para estudiar la dinámica de este receptor por microscopía de fluorescencia, escogimos dos estrategias. Una de ellas es la síntesis de un antagonista fluorescente, que se pueda unir específicamente al receptor. Para ello, realizamos inicialmente estudios de docking y escogimos como candidatos una serie de azaborodipirrometenos (azaBODIPYs). Una segunda estrategia es la marcación a través de un tag llamado ACP (Acyl Carrier protein), que une de forma específica coenzima A, que puede estar funcionalizada con distintos fluoróforos. Esta vía involucra la realización de un clonado para obtener finalmente una línea celular estable que exprese CRHR1 unido a ACP.
Al momento se ha avanzado en los estudios de la fotofísica de compuestos ESIPT y su sensibilidad al medio (polaridad, capacidad de intercambio de portones, temperatura). Se ha sintetizado un aza-BODIPY altamente fluorescente y que se liga a CRHR1 y se han obtenido los plásmidos con CRHR1 y ACP, así como algunas líneas de clones estables que expresan la proteína de fusión.

1 Hell, S. Far-Field Optical Nanoscopy. Science 316, 1153–1158 (2007).
2 Huang, B., Babcock, H. & Zhuang, X. Cell 143, 1047–1058 (2010).