Microscopía de fluorescencia de moléculas individuales y de súper-resolución para el estudio de sistemas biológicos

Alan Szalai, doctor en química e investigador asistente del Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), dictó un seminario para los miembros de este instituto el pasado 14 de julio.

Durante su presentación, el científico destacó que la microscopía de fluorescencia es una de las técnicas más utilizadas en los estudios de sistemas biológicos por su alta especificidad y por ser poco invasiva. Sin embargo, aclaró, “su resolución espacial está limitada por la difracción de la luz a unos 250 nm en la dirección lateral y unos 500 nm en la dirección axial”. Cabe aseñalar que la difracción de la luz es un fenómeno que ocurre cuando las ondas que forman la luz pasan por un orificio estrecho. Entonces, el conjunto de microscopías de súper-resolución, también llamadas nanoscopías de fluorescencia, logró superar esta limitación a través del control de transiciones entre estados oscuros y brillantes de las sondas fluorescentes utilizadas.

En el seminario, Szalai mostró las técnicas que ha desarrollado y contribuido a desarrollar en el campo de las nanoscopías de fluorescencia, y cómo las ha aplicado para estudiar distintos problemas biológicos. En ese marco, presentó dos desarrollos que reflejan la dependencia de las propiedades de los fluoróforos con la distancia a una superficie para obtener su posición axial con precisión nanométrica e incluso por debajo del nanómetro. El primer caso corresponde a la técnica llamada SIMPLER, que aprovecha la dependencia exponencial de la luz de excitación cuando se utiliza excitación por reflexión total interna. En el segundo caso, mostró cómo puede utilizarse la transferencia de energía desde fluoróforos individuales a una superficie de grafeno para localizar moléculas con precisión de unos pocos Ångström, y cómo aprovechar este fenómeno para estudiar interacciones entre ADN y proteínas. 

Finalmente, se refirió a los resultados de la combinación de FRET con la nanoscopía STED, donde “hemos podido sumar a la capacidad de detectar interacciones a escala molecular (FRET) la posibilidad de determinar la ubicación de las moléculas involucradas con una resolución en el orden de 40-50 nm (STED)”. 

La última técnica que presentó es RASTMIN, un método de localización de moléculas individuales que alcanza una precisión de localización de tan solo 1-2 nm. RASTMIN presenta un esquema experimental sencillo, pudiendo aplicarse en un microscopio confocal estándar.