María Florencia Pignataro y Javier Santos - Viernes 19 de septiembre 14:00 hs

El uso de nanoanticuerpos como herramientas novedosas para modular la función del supercomplejo mitocondrial formador de centros hierro-azufre

Los centros hierro-azufre (Fe-S) son cofactores esenciales para el funcionamiento de muchas proteínas. En células eucariotas, la biogénesis de la mayoría de los centros Fe-S ocurre en las mitocondrias e involucra la acción del supercomplejo cisteína desulfurasa (NFS1-ISD11-ACP), el cual es activado cinéticamente por la frataxina (FXN). La disminución en la expresión, estabilidad y/o función de FXN deviene en el desarrollo de la ataxia de Friedreich (FRDA), una enfermedad poco frecuente que afecta a 1 de cada 50.000 personas.
En este trabajo, hemos seleccionado nanoanticuerpos específicos para la FXN humana a través de la estrategia de display en fagos. Dichos nanoanticuerpos demostraron una amplia gama de efectos sobre la actividad de la Cisteína desulfurasa, a través de su interacción con la FXN. Nos enfocamos inicialmente en cuatro nanoanticuerpos que mostraron fuertes interacciones con FXN silvestre (KD = 1–30 nM) y estabilización térmica de la variante G130V de FXN (asociada a FRDA), aumentando su Tm en 15 °C. La interacción entre los nanoanticuerpos y la FXN fue caracterizada mediante diversas herramientas biofísicas, incluyendo RMN, SAXS y cristalografía de rayos X. Tres de los nanoanticuerpos se unen a una región similar de la FXN, y las estructuras de los complejos nanoanticuerpo-FXN correspondientes fueron resueltas por difracción de rayos X, mostrando un modo de unión semejante. En contraste, el cuarto nanoanticuerpo se une a la alfa-hélice 1, según lo determinado por RMN y SAXS.
Los efectos biológicos de la expresión de nanoanticuerpos se estudiaron en líneas celulares humanas (HEK293T y HeLa Kyoto). Se analizaron la localización subcelular, la interacción directa con la FXN en el entorno celular, el efecto sobre la viabilidad, las actividades enzimáticas dependientes de centros Fe-S y las tasas de consumo de oxígeno mitocondrial. La expresión de nanoanticuerpos que comparten el mismo modo de unión no alteró estas variables metabólicas clave, lo que sugiere que la interacción con FXN no interfiere con la ruta. En conjunto, estos resultados sugieren que los nanoanticuerpos pueden actuar como proteínas mitocondriales para investigar la modulación funcional de variantes inestables de FXN asociadas a FRDA.
Actualmente, nos encontramos avanzando en el estudio del efecto de estos nanoanticuerpos en distintos tipos celulares derivados de personas que conviven con ataxia de Friedreich